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PRODUCTION DES METALLOPROTEINASES MATRICIELLES DANS LES VESICULES SEMINALES,LA PROSTATE ET LE CANAL DEFERENT DU MERION DE LIBYE (MERIONES LIBYCUS)AU COURS DE LA PERIODE ACTIVE DU CYCLE REPRODUCTEUR

 

 

Mansouria BELHOCINE1,2,*, ThérèseGERNIGON2, YasminaBENAZZOUG3, Jean-MarieEXBRAYAT4

1  Département des Sciences Agronomiques, Faculté des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie, Université Abdelhamid Ibn Badis-Mostaganem, Algérie

2  Laboratoire de Recherche sur les Zones Arides (LRZA), Reproduction des Petits Vertébrés, Faculté des Sciences Biologiques (FSB), USTHB, 16111 El Alia, Alger, Algérie

3  Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, Matrice Extracellulaire, Faculté des Sciences Biologiques (FSB), USTHB, 16111 El Alia, Alger, Algérie

4  Université de Lyon, Laboratoire de Biologie Générale, UCLy, Laboratoire de Reproduction et Développement Comparé, EPHE, 25 rue du plat, 69288 Lyon cedex, France.

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RESUME : Une étude immunohistochimique des métalloprotéinases matricielles (MMP-3, MMP-7) a été entreprise sur les vésicules séminales, la prostate et le canal déférent pour vérifier leur implication dans la physiologie de la reproduction. Meriones libycus a été collecté dans la région de Béni-Abbès au printemps (période de reproduction). La méthode immunohistochimique indirecte avec amplification à la streptavidine-biotine-peroxydase a été suivie avec l’AEC comme chromogène. Dans les vésicules séminales, la MMP-3 et la MMP-7 sont immunolocalisées dans les cellules épithéliales et les cellules musculaires lisses (CMLs) avec une absence d’immunomarquage dans la matrice extracellulaire (MEC) et la sécrétion. Dans la prostate ventrale,  l’immunoexpression de la MMP-3 et la MMP-7 est concentrée dans le pôle apical des cellules épithéliales avec une légère immunoréponse dans les CMLs et une absence d’immunoréactivité dans la MEC ; la sécrétion, sans immunomarquage et creusée de zones circulaires vides de taille variable, est entourée d’une petite fraction de matériel marqué traduisant une résorption de la sécrétion ce qui facilite son écoulement dans les tubules. Dans la prostate dorsale, les deux MMPs sont aussi immunodétectées dans les cellules épithéliales avec une absence de la MMP-3 et une faible immunoréaction de la MMP-7 dans les CMLs ; l’immunoréactivité est importante dans la sécrétion et inexistante dans la MEC. Dans le canal déférent, les cellules épithéliales et les CMLs expriment fortement les deux MMPs, et la lamina propria manque d’immunomarquage ; la sécrétion apocrine montre un signal positif des deux MMPs. Les MMPs sont impliquées dans le flux de la sécrétion dans la prostate ventrale et sont vraisemblablement engagées dans l’élaboration de la sécrétion et la maturation des spermatozoïdes.


MOTS-CLES : Métalloprotéinases, Glandes accessoires mâles, Reproduction, Rongeurs, Désert.

 

ABSTRACT: An immunohistochemical study of matrix metalloproteinases (MMP-3, MMP-7) was undertaken on the seminal vesicle, prostate and vas deferens of Meriones libycus in order to verify their implication in the cellular process of reproduction. Meriones libycus were collected from Beni-Abbes areas in the spring (breeding period). The work was done using the indirect immunohistochemistry protocol by amplification with streptavidin-biotin-peroxidase and AEC as chromogen. In the seminal vesicles, the MMP-3 and MMP-7 were

immunolocalized in epithelial cells and smooth muscle cells (SMC) without any immunostaining in the extracellular matrix (ECM) and the secretion. In the ventral prostate, MMP-3 and MMP-7 immunoexpressions were concentrated in the apical pole of the epithelial cells with a less immunoresponse in SMC and a lack of immunoreactivity in the ECM. The not immunostained secretion was followed by empty circular areas of variable size and was surrounded by a small amount of an immunolabelled material. This phenomenon reflected a detachment of secretion allowing its movement in the tubules. In the dorsal prostate, there were as well the epithelial cells whose produced MMP-3 and MMP-7 with an absence of MMP-3 and a slight MMP-7 immunoreaction in SMC; the secretion showed a strong immunolabelling. In the vas deferens, epithelial cells, SMC and secretion were strongly immunostained. MMPs are involved in the flow of secretion in the ventral prostate and are probably implicated in elaboration of secretion and subsequently in sperm maturation.


KEYWORDS: Matrix metalloproteinases, Male accessory sex glands, Reproduction, Desert, Rodents.

 

1. INTRODUCTION

     Les métalloprotéinases matricielles (MMPs) sont des endopeptidases extracellulaires dont l’activité est dépendante du Zn2+ et du Ca2+ capables de dégrader tous les composants de la matrice extracellulaire (MEC) et aussi des protéines non matricielles comme les facteurs de croissance et leurs récepteurs, les cytokines et les chémokines, les peptides antimicrobiens, les protéines d’adhésion comme la E cadhérine et les b intégrines, les protéoglycannes de surface et une variété d’enzymes (Nagase, 1997 ; Nagase et al., 2006 ; Page-McCaw et al., 2007). Par leur action protéolytique, elles peuvent produire des fragments bioactifs, libérer les facteurs de croissance immobilisés dans la matrice (Nakamura et al., 2005) et peuvent aussi activer, désactiver ou modifier l’activité des molécules de signalisation engendrant un microenvironnement favorable à l’expression des gènes, la migration cellulaire, la différenciation des cellules, la croissance et la prolifération des cellules, la survie et l’apoptose des cellules. Elles peuvent aussi modifier l’architecture des tissus par leur action sur les protéines de la MEC et le clivage des jonctions intercellulaires et de la lame basale (Stamenkowic, 2003).

Les MMPs sont impliquées dans le remodelage tissulaire associé à des processus physiologiques normaux tels que la reproduction, le développement embryonnaire et la morphogenèse (Walsh et al., 2007)  ainsi que le développement postnatal des organes (Hulboy et al., 1997 ; Hu et al., 2004), le remodelage osseux et cartilagineux (Varghese, 2006 ; Krane et Inada, 2008), la croissance du follicule pileux, l’angiogenèse et l’apoptose, et physiopathologiques comme notamment le cancer où elles sont fortement exprimées (Li et al., 2006 ; Cai et al., 2007), les pathologies cardiovasculaires (Lijnen, 2001 ; Kuzuya et Iguchi, 2003) et les désordres du système nerveux central (Rivera et al., 2004 ; Murphy et Nagase, 2008). 

Les rongeurs des régions tempérées et ceux vivant dans les zones arides se sont adaptés à ne pas se reproduire quand les conditions climatiques sont inappropriées à la croissance des petits. L’arrêt de l’activité reproductrice se manifeste par une atrophie structurale des organes reproducteurs corrélée à une chute de la production hormonale (Belhocine et Gernigon, 1994 ; Young et al., 2000 ; Aguilera-Merlo et al., 2005, 2009 ; Schradin, 2008). Généralement le processus de la régression engendre des organes caractérisés par une accumulation de la matrice extracellulaire, une hypertrophie de la paroi fibromusculaire et une apoptose des cellules épithéliales conduisant à une involution épithéliale (Belhocine et al., 2007 ; Belhocine, 2008); les effets de la castration sont similaires (Belhocine et Gernigon-Spychalowicz, 1996 ; Oliveira et al., 2007 ; Goes et al., 2007 ; Justulin et al., 2006). Les organes en recrudescence montrent une structure opposée avec un stroma dispersé et faiblement concentré, une paroi fibromusculaire mince et un compartiment épithélial largement dominant (El-Bakry et al., 1998 ; Aguilera-Merlo et al., 2005 ; Belhocine et al., 2007). Ces variations saisonnières de structure traduisent un remodelage tissulaire qui ne peut avoir lieu sans l’implication de protéases. Ce phénomène a été observé dans l’ovaire et l’utérus du hamster sibérien (Phodopus sungorus), les MMPs sont à l’origine de la restructuration associée à la régression et la recrudescence de ces organes en réponse aux effets inhibant ou stimulant de la photopériode (Salverson et al., 2008 ; Shahed et Young, 2008). 

Les organes du système reproducteur des femelles subissent un remodelage cyclique de la MEC synchronisé avec les fluctuations cycliques hormonales, les MMPs jouent un rôle crucial dans ce remodelage et dans la physiologie ovarienne et utérine. Dans les ovaires, elles prennent part à toutes les phases de la croissance et l’atrésie folliculaire, l’ovulation, la formation et la lutéolyse du corps jaune (Curry et Osteen, 2003 ; Ohnishi et al., 2005). Dans le remodelage de la matrice extracellulaire de l’endomètre associé aux phases proliférative, sécrétoire, menstruel et au cours de l’implantation (Curry et Osteen, 2003 ; Daimon et Wada, 2005), la gestation, la dilatation cervicale et l’involution postpartum (Manase et al., 2006). Dans la glande mammaire, elles apportent leur contribution pendant les phases du développement, la lactation et l’involution après le sevrage des petits (Green et Lund, 2005). L’importance des MMPs et des TIMPs dans la fonction de reproduction chez les mâles a été démontrée par plusieurs auteurs chez l’homme et les mammifères, les travaux restent néanmoins limités. Des MMPs et des TIMPs ont été décelées dans le plasma séminal de l’homme (Shimokawa et al., 2002, 2003 ; Tentes et al., 2007). L’accumulation des MMPs et des TIMPs dans le fluide testiculaire et épididymaire des animaux domestiques serait un signe de leur fonction dans la maturation des spermatozoïdes (Métayer et al., 2002). Les MMPs auraient aussi un rôle dans la fusion des gamètes lors de la fécondation et dans la réaction acrosomique (Métayer et al., 2002 ; Farach et al., 1987 ; Roe et al., 1988 ; Diaz-Pérez et Meizel, 1992 ; Wolfsberg et al., 1993).

Le testicule est un organe hautement dynamique au cours de la vie fœtale, le développement postnatal et chez l’adulte. Au cours de la spermatogenèse, les cellules germinales doivent traverser la barrière hémato-testiculaire pour migrer du compartiment basal vers le compartiment adluminal. Les jonctions membranaires reliant les cellules germinales à la cellule de Sertoli doivent être brisées ou restructurées pour permettre aux cellules germinales de se mouvoir dans l’épithélium séminifère et atteindre la lumière tubulaire ; au cours de la spermiation les spermatozoïdes sont détachés des cellules de Sertoli. Tous ces phénomènes impliquent des ruptures et des remises en place de ces barrières à la suite d’une protéolyse des protéines jonctionnelles et leur resynthèse. De toute évidence un système de protéases est requis pour accomplir tous ces évènements cellulaires. Ce système enzymatique est représenté par les sérines protéases et les MMPs. Celles-ci sont produites par les cellules de Sertoli, les cellules germinales, les cellules de Leydig et les cellules péritubulaires (Huang et al., 2007 ; Le Magueresse-Battistoni, 2007) L’objectif de notre étude est de vérifier l’implication des MMPs dans les processus cellulaires de la fonction de reproduction du Mérion de Libye.

 

2. MATERIELS ET METHODES

2.1. Les animaux

   Le Mérion de Libye est un rongeur saharien nocturne appartenant à la famille des Gerbillidés, son régime alimentaire est à la fois herbivore et granivore. Il vit dans des terriers superficiels creusés sous les buissons les plus importants profitant de l’ombre que la plante procure. Dans le Sahara algérien Meriones libycus se reproduit selon un cycle saisonnier caractérisé par une courte période de reproduction (printemps-début de l’été) et une longue phase de repos (fin de l’été-fin de l’hiver).  Meriones libycus a été capturé de la région de Béni-Abbès dans le sud ouest du Sahara algérien au milieu de la phase active par piégeage. Le piège est une cage grillagée appâtée avec des dattes et de l’orge grillée. C’est à la tombée de la nuit, juste avant les sorties nocturnes que les cages ont été déposées à proximité des orifices des terriers habités reconnaissables d’après les traces fraiches. Les Mérions piégés ont été récupérés tôt le matin puis transportés au laboratoire où les mâles adultes ont été placés dans des cages collectives (5 animaux par cage). Une nourriture composée de grains d’orge leur a été administrée quotidiennement. Après un séjour variable de 24 à 48 heures, 14 Mérions mâles adultes ont été sacrifiés entre 17 et 19 heures en raison de leur activité nocturne.

 

2.2. Immunohistochimie

  Les vésicules séminales, la prostate ventrale, la prostate dorsale et le canal déférent ont été soigneusement prélevés, dégraissés, pesés puis fixés dans le Bouin-Hollande pendant 48 heures ou le formol neutre tamponné à 10% pendant 24 heures. Après déshydratation dans l’éthanol à concentration croissante jusqu’à l’éthanol absolu (70°, 96°, 100°) ces organes ont été inclus dans la paraffine. Les coupes de 5µm d’épaisseur ont été étalées sur des lames superfrost couvertes de quelques gouttes d’eau stérile. Les anticorps utilisés sont : [MMP-3: Mouse anti-human MMP-3 monoclonal antibody (AbCys); MMP-7: Mouse anti-human MMP-7 monoclonal antibody (AbCys)].

La technique immunohistochimique employée est la méthode immunohistochimique indirecte avec amplification à la streptavidine-biotine-peroxydase selon le protocole d’immunohistochimie KIT LSAB2 (DAKO) peroxydase. Les coupes ont été déparaffinées par immersions successives dans deux bains de cyclohexane de 15 minutes chacun et hydratées pendant 5 minutes chacun dans des bains d’éthanol à degré décroissant 100°, 95° et 70° puis rincées dans l’eau distillée pendant 2 minutes. Après un rinçage de 2 minutes dans du PBS, les coupes ont été entourées d’une résine hydrophobe (DAKO-Pen) puis incubées pendant 5 minutes dans le mélange PBS-H2O2 à 3 % pour bloquer les peroxydases endogènes. Les sites antigéniques non spécifiques ont été masqués en incubant les lames pendant 10 minutes dans la solution PBS/BSA à 1% après un rinçage au PBS.

L’anticorps primaire (anti-MMP-3, dilution : 1/500 ; anti-MMP-7, dilution : 1/200) a été ensuite appliqué sur les coupes pendant une heure à température ambiante à raison de 100 ml par coupe. Les lames ont été ensuite rincées trois fois 10 minutes au PBS puis incubées dans l’anticorps secondaire biotinylé pendant une heure à température ambiante. Après 3 rinçages au PBS de 10 minutes chacun, le complexe streptavidine-peroxydase a été appliqué sur les coupes pendant une heure à température ambiante. Les coupes ont été ensuite rincées 3 fois 10 minutes au PBS puis incubées dans le complexe substrat-chromogène pendant 10 minutes à température ambiante. Les coupes ont été rincées dans l’eau distillée puis contre-colorées à l’hématoxyline QS spéciale pour immunohistochimie qui colore les noyaux en bleu-violet. Le montage des lames a eu lieu en milieu aqueux avec le VectaMount AQ (VECTOR laboratories). Les contrôles négatifs ont été réalisés par omission de l’anticorps primaire (témoin négatif 1) ou l’anticorps secondaire (témoin négatif 2) en les remplaçant par le PBS. L’observation et les photographies ont été effectuées sur un photo-microscope Nikon Eclipse E400 muni d’une caméra numérique Nikon DXM1200.

 

3. RESULTATS

3.1. Immunohistochimie de la MMP-3 et la MMP-7 dans les vésicules séminales

  Dans les vésicules séminales de Meriones libycus, la MMP-3 et la MMP-7 sont exprimées dans les cellules épithéliales (ˆ) et les cellules musculaires lisses (CMLs) (Fig. "1 a, b" ; "2 a, b"). Les cellules épithéliales (ˆ) et les CMLs expriment la MMP-3 et la MMP-7 avec la même intensité et l’aspect morphologique de cet immunomarquage est homogène (Fig. "1 a, b" ; "2 a, b"). Le stroma sous-épithélial (lamina propria) (¤) et le stroma logé dans l’axe des replis épithéliaux (k) ainsi que l’espace interstitiel (Œ) inséré entre les CMLs manquent d’immunoréaction à la MMP-3 et la MMP-7 (Fig. "1 a, b" ; "2 a, b").

 

3.2. Immunohistochimie de la MMP-3 et la MMP-7 dans la Prostate ventrale

  La MMP-3 et la MMP-7 sont concentrées dans les cellules épithéliales (ˆ) et légèrement exprimées dans les CMLs. La sécrétion (S) sans immunomarquage aux deux enzymes est entourée par un produit marqué (q) qui semble avoir digéré la sécrétion initiale et provoqué les trous ronds vides (˜) visibles dans la masse de sécrétion (S) (Fig. "1 c, d" ; "2 c, d").

 

3.3. Immunohistochimie de la MMP-3 et la MMP-7 dans la Prostate dorsale

  La MMP-3 et la MMP-7 sont fortement exprimées dans les cellules épithéliales (ˆ) et dans la sécrétion (S). Dans les CMLs, la MMP-3 est absente et la MMP-7 est légèrement exprimée (Fig. "1 e, f" ; "2 e, f").

 

3.4. Immunohistochimie de la MMP-3 et la MMP-7 dans le canal déférent

  Dans le canal déférent, les cellules épithéliales (ˆ) et les CMLs expriment fortement et avec un taux identique la MMP-3 et la MMP-7, l’immunomarquage est surtout concentré aux extrémités apicale et basale des cellules. La lamina propria (k) incluse entre le compartiment épithélial et musculaire est dépourvue d’immunomarquage. Dans la lumière du canal déférent sont présentes des vésicules de sécrétion apocrine (^) attachées aux microvillosités apicales avec un signal immunohistochimique positif des deux métalloprotéinases (Fig. "1 g, h" ; "2 g, h").

Dans tous les témoins négatifs préparés par omission de l’anticorps primaire le signal immunohistochimique des deux MMPs est négatif.

 

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